Наказ МОЗ № 4-a від 14.01.2015 ІНСТРУКЦІЯ щодо приготування та використання контрольних зразків для внутрішньолабораторного контролю якості досліджень
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ Міністерства охорони
здоров’я України
14.01.2015 № 4
Зареєстровано в Міністерстві
юстиції України
30 січня 2015 р.
за № 113/26558
ІНСТРУКЦІЯ
щодо приготування та використання контрольних зразків для внутрішньолабораторного контролю якості досліджень
1. Ця Інструкція визначає порядок приготування та використання внутрішньолабораторного контрольного зразка (далі – ВКЗ).
2. У цій Інструкції наведені нижче скорочення вживаються у таких значеннях:
ВКЗ – внутрішньолабораторний контрольний зразок;
ІФА – імуноферментний аналіз;
КП – коефіцієнт позитивності;
CV – коефіцієнт варіації;
ОГ – оптична густина (англ. – optical dencity (OD));
ОГкрит (англ. – Cut off (CO)) – порогове (критичне) значення оптичної густини або оптичного сигналу.
3. Приготування ВКЗ здійснюється у декілька етапів:
1) підготовчий етап, який передбачає отримання достатньої кількості сироватки крові для приготування ВКЗ, включає:
а) приготування позитивного зразка сироватки крові, що включає приготування достатньої кількості матеріалу для роботи протягом півроку або року. Для цього беруть сироватку крові від одного пацієнта або суміш сироваток крові з високими значеннями ОГ, отриманих при дослідженні на наявність антитіл до ВІЛ за допомогою декількох наборів реагентів (тест-систем). При цьому матеріал не повинен містити серологічних маркерів збудників гепатитів В і С та антитіл до збудника сифілісу блідої трипонеми (Treponema pallidum).
З метою видалення преципітатів (часточок фібрину) матеріал необхідно центрифугувати при ~500g з подальшою фільтрацією (за необхідності).
Кожну порцію сироватки, отриману від ВІЛ-позитивної особи, заморожують при температурі мінус 20°С і зберігають в таких умовах до досягнення необхідного сумарного об’єму;
б) приготування негативного зразка сироватки крові, що включає приготування сироватки (або попередньо тромбінізованої/рекальцифікованої плазми крові людини), що не містить антитіл до ВІЛ 1/2, маркерів збудників гепатитів В і С та антитіл до збудника сифілісу блідої трипонеми (Treponema pallidum);
2) етапу приготування ВКЗ, який складається з:
а) приготування суміші сироваток:
індивідуальні зразки сироваток крові розморожують при кімнатній температурі.
Впевнившись у відсутності механічних домішок, бактеріального проросту та мутності, до чого призводить присутність ліпідів, об’єднують сироватки у відповідній ємності/посудині (одноразового застосування).
Ємність герметично закривають та ретельно перемішують шляхом багаторазового перевертання, не допускаючи утворення піни (бажане використання магнітної мішалки).
Аліквоту отриманої зливної сироватки додатково аналізують методом імунного блоту і після підтвердження позитивного результату використовують для підбору розведення. Частину, яка залишилася, зберігають у холодильнику при температурі плюс 4°С протягом часу, необхідного для підготовки ВКЗ;
б) підбору кінцевого розведення ВКЗ, що здійснюють шляхом визначення ОГ при аналізі методом ІФА в серії багаторазових поетапних розведень позитивного матеріалу (суміші сироваток) з інтервалом «2» (тобто у співвідношенні 1:1, наприклад 100:100 мкл). Для розведення використовують негативну сироватку. Процедуру розведення проводять безпосередньо в плашці, однорідності досягають шляхом багатократного піпетування.
Співвідношення ОГ контрольного зразка в кінцевому розведенні і критичного значення ОГ (ОГ/ОГкрит) повинно становити:
від 2,0 до 2,5 – для зразка ВКЗ з низьким вмістом антитіл до ВІЛ (такий ВКЗ доцільно використовувати для попередження хибно негативних та хибно позитивних результатів дослідження);
від 3,0 до 4,0 – для зразка ВКЗ, що містить антитіла до ВІЛ в більш високій концентрації.
Підготовлений зразок ВКЗ досліджують декілька разів методом ІФА (не менше 5 разів), визначають ОГ/ОГкрит і розраховують показники відтворюваності. Якщо CV не перевищує 10 %, зразок ВКЗ придатний до використання.
Для кожного найменування тест-систем готують окремі зразки ВКЗ.
4. Розрахунки об’ємів ВКЗ з необхідним кінцевим розведенням здійснюють відповідно до обсягів роботи лабораторій протягом 6 місяців за умови зберігання ВКЗ в порціях по 0,5-1,0 мл і використання протягом одного робочого дня. Після цього поетапно готують необхідний об’єм ВКЗ відповідно до наведеного нижче прикладу.
Приклад приготування 32 мл сироватки ВКЗ (1:128):
до 250 мкл позитивного матеріалу (суміші сироваток) необхідно додати 750 мкл негативної сироватки. Ретельно перемішати (20-30 разів). До приготованої таким чином суміші сироваток необхідно додати ще 7 мл негативної сироватки, після чого ретельно перемішати (20-30 разів). Отримані 8 мл розведеної позитивної сироватки необхідно розвести в 24 мл негативної сироватки та ретельно перемішати.
З метою запобігання нерівномірному розподіленню антитіл у ВКЗ та отримання контрольних зразків з різною їх концентрацією не допускається одразу змішувати весь об’єм позитивної сироватки з негативною.
ВКЗ розливають у пластикові пробірки одноразового використання (типу «епендорф») з кришками, що закручуються, з розрахунку потреб на 1 день роботи лабораторії. Пробірки з ВКЗ маркують та зберігають протягом 6 місяців при температурі мінус 20°С та нижче.
При використанні ВКЗ допускається лише одноразове їх розморожування при кімнатній температурі з подальшим ретельним перемішуванням, використанням і зберіганням при температурі плюс 4°С протягом 24 годин. Надалі з ВКЗ поводяться так, як з досліджуваним зразком сироватки крові. Їх дослідження здійснюють у кожній тест-системі, що використовують в лабораторії.
Директор Департаменту
медичної допомоги
С. Хотіна
Наказ Міністерства охорони
здоров’я України
14.01.2015 № 4
Зареєстровано в Міністерстві
юстиції України
30 січня 2015 р.
за № 113/26558
ІНСТРУКЦІЯ
щодо приготування та використання контрольних зразків для внутрішньолабораторного контролю якості досліджень
1. Ця Інструкція визначає порядок приготування та використання внутрішньолабораторного контрольного зразка (далі – ВКЗ).
2. У цій Інструкції наведені нижче скорочення вживаються у таких значеннях:
ВКЗ – внутрішньолабораторний контрольний зразок;
ІФА – імуноферментний аналіз;
КП – коефіцієнт позитивності;
CV – коефіцієнт варіації;
ОГ – оптична густина (англ. – optical dencity (OD));
ОГкрит (англ. – Cut off (CO)) – порогове (критичне) значення оптичної густини або оптичного сигналу.
3. Приготування ВКЗ здійснюється у декілька етапів:
1) підготовчий етап, який передбачає отримання достатньої кількості сироватки крові для приготування ВКЗ, включає:
а) приготування позитивного зразка сироватки крові, що включає приготування достатньої кількості матеріалу для роботи протягом півроку або року. Для цього беруть сироватку крові від одного пацієнта або суміш сироваток крові з високими значеннями ОГ, отриманих при дослідженні на наявність антитіл до ВІЛ за допомогою декількох наборів реагентів (тест-систем). При цьому матеріал не повинен містити серологічних маркерів збудників гепатитів В і С та антитіл до збудника сифілісу блідої трипонеми (Treponema pallidum).
З метою видалення преципітатів (часточок фібрину) матеріал необхідно центрифугувати при ~500g з подальшою фільтрацією (за необхідності).
Кожну порцію сироватки, отриману від ВІЛ-позитивної особи, заморожують при температурі мінус 20°С і зберігають в таких умовах до досягнення необхідного сумарного об’єму;
б) приготування негативного зразка сироватки крові, що включає приготування сироватки (або попередньо тромбінізованої/рекальцифікованої плазми крові людини), що не містить антитіл до ВІЛ 1/2, маркерів збудників гепатитів В і С та антитіл до збудника сифілісу блідої трипонеми (Treponema pallidum);
2) етапу приготування ВКЗ, який складається з:
а) приготування суміші сироваток:
індивідуальні зразки сироваток крові розморожують при кімнатній температурі.
Впевнившись у відсутності механічних домішок, бактеріального проросту та мутності, до чого призводить присутність ліпідів, об’єднують сироватки у відповідній ємності/посудині (одноразового застосування).
Ємність герметично закривають та ретельно перемішують шляхом багаторазового перевертання, не допускаючи утворення піни (бажане використання магнітної мішалки).
Аліквоту отриманої зливної сироватки додатково аналізують методом імунного блоту і після підтвердження позитивного результату використовують для підбору розведення. Частину, яка залишилася, зберігають у холодильнику при температурі плюс 4°С протягом часу, необхідного для підготовки ВКЗ;
б) підбору кінцевого розведення ВКЗ, що здійснюють шляхом визначення ОГ при аналізі методом ІФА в серії багаторазових поетапних розведень позитивного матеріалу (суміші сироваток) з інтервалом «2» (тобто у співвідношенні 1:1, наприклад 100:100 мкл). Для розведення використовують негативну сироватку. Процедуру розведення проводять безпосередньо в плашці, однорідності досягають шляхом багатократного піпетування.
Співвідношення ОГ контрольного зразка в кінцевому розведенні і критичного значення ОГ (ОГ/ОГкрит) повинно становити:
від 2,0 до 2,5 – для зразка ВКЗ з низьким вмістом антитіл до ВІЛ (такий ВКЗ доцільно використовувати для попередження хибно негативних та хибно позитивних результатів дослідження);
від 3,0 до 4,0 – для зразка ВКЗ, що містить антитіла до ВІЛ в більш високій концентрації.
Підготовлений зразок ВКЗ досліджують декілька разів методом ІФА (не менше 5 разів), визначають ОГ/ОГкрит і розраховують показники відтворюваності. Якщо CV не перевищує 10 %, зразок ВКЗ придатний до використання.
Для кожного найменування тест-систем готують окремі зразки ВКЗ.
4. Розрахунки об’ємів ВКЗ з необхідним кінцевим розведенням здійснюють відповідно до обсягів роботи лабораторій протягом 6 місяців за умови зберігання ВКЗ в порціях по 0,5-1,0 мл і використання протягом одного робочого дня. Після цього поетапно готують необхідний об’єм ВКЗ відповідно до наведеного нижче прикладу.
Приклад приготування 32 мл сироватки ВКЗ (1:128):
до 250 мкл позитивного матеріалу (суміші сироваток) необхідно додати 750 мкл негативної сироватки. Ретельно перемішати (20-30 разів). До приготованої таким чином суміші сироваток необхідно додати ще 7 мл негативної сироватки, після чого ретельно перемішати (20-30 разів). Отримані 8 мл розведеної позитивної сироватки необхідно розвести в 24 мл негативної сироватки та ретельно перемішати.
З метою запобігання нерівномірному розподіленню антитіл у ВКЗ та отримання контрольних зразків з різною їх концентрацією не допускається одразу змішувати весь об’єм позитивної сироватки з негативною.
ВКЗ розливають у пластикові пробірки одноразового використання (типу «епендорф») з кришками, що закручуються, з розрахунку потреб на 1 день роботи лабораторії. Пробірки з ВКЗ маркують та зберігають протягом 6 місяців при температурі мінус 20°С та нижче.
При використанні ВКЗ допускається лише одноразове їх розморожування при кімнатній температурі з подальшим ретельним перемішуванням, використанням і зберіганням при температурі плюс 4°С протягом 24 годин. Надалі з ВКЗ поводяться так, як з досліджуваним зразком сироватки крові. Їх дослідження здійснюють у кожній тест-системі, що використовують в лабораторії.
Директор Департаменту
медичної допомоги
С. Хотіна